Biotechnologies

II - Industries chimiques et pharmaceutique

Les champignons sont utilisés par l’industrie chimique pour la synthèse de métabolites primaires et secondaires, d’enzymes, ainsi que pour la biotransformation de substrats divers.

A - Systèmes de culture

En présence d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs et des conditions d’environnement satisfaisantes, une population de cellules fongiques particulière va se développer avec un taux de croissance spécifique, résultant d’une augmentation de la biomasse (nombre de cellules, poids sec, quantité d’acides nucléiques et de protéines).

Dans un milieu de culture homogène (agité), quatre étapes de croissance peuvent être distinguées : la phase lag, la phase exponentielle, la phase stationnaire, et la phase de déclin (mort cellulaire et autolyse).
Une relation peut être établie entre le taux de croissance en phase exponentielle et le temps de doublement de la population, conséquence du temps de division cellulaire (temps de génération).
Au cours de la phase de croissance exponentielle se produit le métabolisme primaire, correspondant à la production d’énergie et la synthèse d’acide nucléique, de protéines, de lipides et d’hydrates de carbone.
L’intérêt industriel réside dans la synthèse de protéines particulières, comme des enzymes capables de dégrader des macromolécules (amylases, cellulases, protéases).

1 - Système de culture fermé

Dans un système fermé, c’est-à-dire dans un volume donné de milieu de culture, la croissance se poursuit à une vitesse uniforme jusqu’à ce qu’une limite physique soit rencontrée (bords de la boîte de Petri, autre colonie), que les éléments nutritifs essentiels soient épuisés ou que des produits métaboliques toxiques (ions hydrogène, ammoniaque) soient accumulés dans le milieu.
Le métabolisme secondaire a lieu au cours de la phase stationnaire et correspond à la production de composants non essentiels à la croissance, jouant un rôle mal connu dans la vie du champignon, mais qui présentent parfois un intérêt industriel considérable (pénicilline, alcaloïdes, ...).
De nombreux métabolites secondaires, dont la production est favorisée par un excès de carbone, dérivent de l’acétyl CoA.

2 - Système du culture ouvert

Les systèmes ouverts correspondent à des cultures continues et peuvent être homogènes et hétérogènes.
Au cours des cultures continues, les plus utilisées dans les laboratoires et l’industrie, le milieu liquide est continuellement remplacé à une vitesse de renouvellement contrôlée pour maintenir le volume total constant.
De tels systèmes de culture, qui nécessitent une agitation régulière et une alimentation constante en air stérile, présentent une quantité de biomasse qui reste constante pendant des semaines ou des mois.
Les variables importantes sont le taux de dilution, c’est-à-dire la vitesse à laquelle le milieu de culture est renouvellé, et la concentration des éléments nutritifs, qui déterminent le taux de croissance spécifique et la quantité de biomasse produite (chemostat, turbidostat).

Les espèces levuriennes déjà nommées et quelques autres : Schizosaccharomyces pombe, Candida tropicalis, Schwanniomyces diastaticus… permettent de valoriser des sous-produits d’industries alimentaires.
A partir de mélasses de canne ou de betterave sucrière, de lactosérum de fromagerie, de lessives de distillerie, sont produites, industriellement, diverses substances (alcools, acides, enzymes…) dont certaines destinées au secteur alimentaire : glycérol, acide succinique, b-galactosidases, niacine, riboflavine…

B - Métabolites primaires

1 - Acides organiques

L’acide citrique (utilisé dans l’industrie alimentaire : boisson, confiture, etc., dans l’industrie pharmaceutique et des cosmétiques, dans l’industrie des plastiques sous la forme d’esters, dans la purification des métaux grâce à son pouvoir chélatant) est produit par A. niger qui possède une forte activité citrate synthétase, ainsi que l’acide gluconique (thérapeutique des carences calcique, acidulant dans l’industrie alimentaire) ; l’acide citrique peut également être produit par Yarrowia lipolytica à partir de n-alcanes ; l’acide fumarique (surtout utilisé dans l’industrie des plastiques) par Rhizopus nigricans ou R. arrhizus ; l’acide érythorbique par Penicillium notatum ; l’acide itaconique (industrie des peintures et des plastiques) par Aspergillus terreus ; l’acide kojique par A. flavus.

2 - Lipides

Les végétaux représentent actuellement la source principale de lipides pour l’alimentation humaine. Mais les champignons sont également capables de produire d’importantes quantités de lipides.
De nombreuses espèces fongiques (Candida, Hansenula, Lipomyces, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, etc.) sont capables de produire de telles substances à partir de substrats divers, tels que les n-alcanes, la mélasse, des sucres divers, etc.
Les lipides produits peuvent être de composition très diverse, comprenant des tri-, di- et monoacylglycérols, des stérols, des phospholipides, des glycolipides, et des acides gras libres (acide palmitique, acide stéarique, acide oléique, acide linoléique, acide arachidonique, etc.).
Trichoderma reesii est utilisé pour la production de lipides à partir de déchets agricoles, comme Aspergillus ochraceus, important producteur d’acide linoléique.

3 - Polysaccharides

Les polysaccharides trouvent des applications dans l’industrie alimentaire, l’extraction du pétrole (émulsifiants), la médecine (substituts du plasma).
Ils sont extrait des plantes ou des algues, mais leur production microbiologique a l’avantage de fournir une grande diversité de molécules facilement extractibles (production extracellulaire), en quantité et qualité satisfaisantes indépendamment des conditions climatiques, et modifiables en faisant varier les conditions de cultures.
Le chitosane est produit par Rhizopus oryzae, le pullulane par Aureobasidium pullulans, le scléroglucane par Sclerotium glucanicum.

4 - Vitamines

La riboflavine est synthétisée par un champignon levuriforme, Ashbya gossypii, le b-carotène, qui peut servir de précurseur de la vitamine A, par Blakeslea trispora ou Rhodotorula gracilis et l’ergostérol, convertible en vitamine D par les rayonnements ultra-violets, par Saccharomyces cerevisiae ou Aspergillus niger.

5 - Acides aminés

Les 2/3 des acides aminés produits sont utilisés pour la nutrition humaine (glutamate dans les assaisonnements, aspartame (asparagine + phénylalanine) comme édulcorant).
Près d’un tiers sert à la nourriture des animaux, pour compléter les plantes d’alimentation, généralement pauvres en acides aminés (méthionine, lysine).
Les applications médicales ne concernent qu’un pour cent de la production en acide aminés : il s’agit de mélanges d’acides aminés utilisés directement au cours des ulcères (glutamine, histidine), des maladies hépatiques (citrulline, ornithine), ou de dérivés, comme la dihydroxyphénylalanine, administré au cours de la maladie de Parkinson, de dérivés de la proline, actifs contre l’hypertension, etc.
Ainsi le L-tryptophane peut être produit par Hansenula anomala à partir de précurseurs comme l’acide anthranilique.

6 - Polyols

De nombreuses espèces fongiques produisent des polyols.
C’est le cas de Candida zeylanoides, qui fournit du meso-érythritol et du mannitol à partir de n-alcanes, de Yarrowia lipolytica (mannitol), Candida tropicalis (arabitol), Pichia miso (glycérol, arabitol, érythritol), etc.

7 - Alcools (bioénergie et biofuel)

L’éthanol est un produit de base pour l’industrie chimique, et sert de succédané à l’essence pour certains moteurs à explosion, en addition ou substitution des produits pétroliers.
Les 4/5^ème de l’éthanol produit dans le monde sont obtenus par fermentation (le reste étant synthétisé à partir de l’éthylène) à partir de sources renouvelables et disponibles en grandes quantités (sucres et amidon d’origine agricole, cellulose des déchets industriels et urbains).
Les levures, essentiellement des souches du genre Saccharomyces, grâce à leurs hautes capacités fermentaires, peuvent assurer la bioconversion de nombreux produits végétaux en éthanol.
Les matières premières disponibles pouvant conduire à la fabrication d'alcool-carburant sont réparties en trois groupes.
a) Classiquement, la biosynthèse de l‘éthanol s’effectue avec Saccharomyces cerevisiae qui est capable de fermenter directement le jus de betterave, plus difficilement les mélasses (en raison de trop fortes concentrations en produits non glucidiques), et seulement après hydrolyse, les substrats glucidiques tels que le glucose, le fructose et le saccharose. Des co-cultures permettent d’augmenter le rendement de production d’éthanol (Endomycopsis fibuliger / Saccharomyces cerevisiae ; Aspergillus niger / Saccharomyces cerevisiae).

Les produits sucrés contenant des composés hydrocarbonés sous forme de mono ou dissacharides, donc directement fermentescibles ; c'est le cas des mélasses de betteraves et de cannes à sucre ; on évalue actuellement à 3,3 tonnes la quantité moyenne de mélasse nécessaires à l'obtention de 1 tonne d'alcool. Dans ce groupe, une place particulière doit être faite à l'inuline, polyoside de réserve plus complexe présent dans les artichauts et les topinambours mais directement hydrolysé et fermenté en alcool avec un bon rendement par certaines espèces de levures telles que Kluyveromyces fragilis, Candida macedoniensis, Torulopsis colliculosa, etc.

b) Les produits amylacés, présents dans les tubercules, racines ou graines : les réserves glucidiques sont, dans ce cas, sous forme d'amidon non directement fermenté par les levures. La préparation du moût de fermentation nécessite alors une hydrolyse par voie chimique ou par voie enzymatique, ce qui augmente les prix de production de l'éthanol. En climat tropical (Brésil, Indonésie, etc.), les racines de manioc sont une source prometteuse : 10 tonnes de manioc permettent de préparer 1 tonne d'alcool. Parmi les graines amylacées, le riz en Asie, le maïs aux Etats-Unis, l'avoine et le seigle en Europe de l'Est sont utilisés depuis longtemps comme source d'éthanol.

La fermentation alcoolique à partir de ces matières premières, notamment les céréales, et en particulier le blé, ne pose pas de problèmes sur le plan technique. Les déchets, tels que le gluten et le son, devront être valorisés.

c) Les produits cellulosiques qui nécessitent, comme dans le cas de l'amidon, un prétraitement hydrolytique destiné à libérer les monomères glucidiques de la cellulose. L’utilisation de produits ligno-cellulosiques nécessite encore des études pour les optimiser, en particulier en ce qui concerne la qualité de l’hydrolysat servant de substrat. Cela implique l'intervention de cellulases produitent essentiellement par des moisissures du genre Aspergillus ou Trichoderma, ou la réalisation de cultures mixtes levures-bactéries, ces dernières assurant la dégradation de la cellulose en glucides qui seront alors fermentés par des levures. Cette technologie étant difficile à mettre en œuvre, il vaut mieux envisager l'utilisation de souches de levures auxquelles on aura conféré, par manipulation génétique, des propriétés cellulasiques.

L’amélioration des souches de Saccharomyces cerevisiae, ou la recherche d’espèces plus performantes pour la production d’éthanol, vise à produire des souches possèdant les propriétés suivantes : thermophilie, tolérance aux fortes concentrations alcooliques, capacité de métaboliser un taux élevé de substrat et plusieurs substrats différents, voire des substrats complexes.

C - Métabolites secondaires

Les métabolites secondaires se caractérisent par le fait que leur production n’est pas indispensable à la croissance du microorganisme, qu’ils sont de structure et d’activité biologique des plus diverses, qu’ils possèdent des voies de synthèse qui leurs sont propres à partir de produits du métabolisme primaire, que leur synthèse est dirigée par un ensemble de gènes auxquels sont souvent associés des gènes de régulation et de résistance, et qu’ils ne sont généralement produits que par un nombre limité d’organismes.
Les métabolites secondaires sont généralement produits en faible quantité (1 à 20 mg/l) par les souches sauvages, alors qu’une production ne devient rentable qu’à partir d’une synthèse de 5 g/l. Ø L’amélioration du rendement repose sur l’optimisation des procédés de fermentation et la modification des souches, par recherche de mutants spontanés, par mutation dirigée lorsque les bases génétiques de la biosynthèse du métabolite sont connues, ou encore par construction de souches par croisement, fusion de protoplastes ou manipulation génétique.

1 - Acides et alcaloïdes

Cercospora rosicola et Botrytis cinerea synthétisent l’acide abscissique, chaque espèce sur un milieu différent.
L’acide gibbérellique est produit à partir de Fusarium moniliforme.
Claviceps purpurea fournit plus de 40 alcaloïdes différents, dérivés d’un noyau tétracyclique (ergoline), et aux très nombreux usages thérapeutiques : hémorragies utérines (méthylergométrine), migraine (ergotamine, dihydroergotamine), syndromes orthostatiques, insuffisance veineuse fonctionnelle (dihydroergotamine), perturbations fonctionnelles neuro-psychiques et psycho-motrices (dihydroergotoxine), certaines stérilités, aménorrhées et galactorrhées (bromocryptine). La production des alcaloïdes s’effectue dans des cellules riches en lipides, comparables au cellules du sclérote, obtenues sur mileux riches en glucides, contenant des sels ammoniacaux, des acides carboxyliques et du phosphate.

2 - Antibiotiques, immunodépresseurs et immunostimulants

Dans certaines conditions de culture, certaines espèces de champignons produisent des antibiotiques qui ont trouvés des applications thérapeutiques importantes : acide aspergillique par A. flavus, amudol par Penicillium martensii, céphalosporines (résistantes aux b-lactamines de Staphylococcus aureus) par Cephalosporium acremonium, cytochalasines par diverses espèces, dont Helminthosporium dematioideum, fumagilline par A. fumigatus, griséofulvine (antibiotique antifongique actif contre les dermatophytes) par Penicillium griseofulvum, pénicillines par Penicillium chrysogenum, variotine par Paecilomyces variotii, acide fusidique par Fusidium coccineum, cérulénine par Cephalosporium caerulens..
Des recherches intensives sont développées pour recherchées de nouvelles molécules antibiotiques.
Les travaux visant à l’augmentation du rendement et la modification de la régulation des b-lactamines par voie génétique, chez les souches productrices de pénicillines et de céphalosporines, ont pour cible les enzymes b-lactamine synthases (AC synthétase, cyclase, expandase, acyltransférase, etc.).
L’isolement et le clonage des systèmes entiers de biosynthèse des antibiotiques dans différent souches microbiennes peut conduire à la production de nouveaux antibiotiques “hybrides”.

La cyclosporine A est synthétisée par plusieurs champignons, dont Tolypocladium inflatum.
Cet immunodépresseur et son dérivé FK506 ont révolutionné la transplantation d’organes et de moelle, par leurs propriétés de blocage de la synthèse de l’interleukine 2, inhibant la multiplication des cellules T auxilliaires et des cellules T cytotoxiques.
Originellement détectées par criblage d’antibiotiques à partir de microorganismes, ces molécules bloquent le système immunitaire en inhibant l’activation des gènes codants pour les facteurs de l’immunité.
Toutefois, cette suppression ne doit pas être totale afin de laisser au système immunitaire un minimum de capacité pour lutter contre les infections.
Ainsi, les effets secondaires indésirables à l’utilisation de la cyclosporine ne sont pas rares, et comprennent notamment une augmentation du risque de développement d’un cancer lors des traitements au long cours.
On estime généralement que l’origine de cette augmentation du risque d’un développement cancéreux réside dans l’incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules cancéreuses, probablement parce que le système immunitaire ne peut ni détecter ni répondre aux protéines spécifiquement associées aux tumeurs.

Mécanisme d’action classique de la cyclosporine

Après fixation à la cyclophiline, la cyclosporine inhibe la calcineurine, qui élimine normalement un groupement phosphate au Facteur Nucléaire des cellules T activées (NF-AT). Cette déphosphorylation devrait conduire à la pénétration dans le noyau du NF-AT, où il stimule l’expression des gènes codant pour l’interleukine 2 et d’autres cytokines.

L’inhibition de cet enchaînement par la cyclosporine bloque l’expression des cytokine et, par conséquent, la réponse immunitaire

Une autre explication possible serait que la cyclosporine elle-même pourrait altérer les caractéristiques de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses, aussi bien in vitro que in vivo.
Le mécanisme en serait l’induction de la synthèse d’une molécule par la cyclosporine, le “ Transforming Growth Factor-b ” (TGF-b).
Le TGF-b serait alors responsable de la stimulation du développement des cancers existants, provoquer des lésions hépatiques, cutanées, rénales et cardiaques, inhiber la réponse immunitaire

La stimulation non spécifique du système immunitaire peut complèter l’action des antibiotiques ou améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux.
Des polysaccharides (b-D-glucanes), produits par certaines espèces fongiques (Coriolus versicolor, Lentinus edodes, Poria cocos, Schizophyllum commune) possèdent de telles propriétés.

3 - Arômes

Les champignons synthétisent des molécules d’arômes complexes, constituant des métabolites secondaires.
De très nombreuses espèces fongiques sont productrices d’arômes.
A titre d’exemples, on peut citer Penicillium roquefortii, Ceratocystis moniliformis (6-méthyl-butylacétate à l’arôme de banane), Ceratocystis variospora (citronellol, acétate de citronnellyl, géranial à l’arôme de rose), Mycoacia uda (p-tolualdéhyde à l’arôme d’amande, alcool p-a-diméthyl phénylique à l’odeur d’herbe), etc.

4 - Enzymes

De nombreuses enzymes industrielles, généralement des hydrolases, sont produites par les champignons. Il s’agit d’enzymes endocellulaires (glucose oxydase, catalase, lactase, pénicilline acylase, glucose isomérase, invertase) ou exocellulaires (amylases, amyloglucosidases, pectinases, cellulases, glucanases, lipases, protéases).

D - Biolixiviation

L’industrie de l’extraction des minerais se trouvent souvent confrontée au problème de la diminution de la richesse des minerais riches, ce qui conduit à forer des galeries de plus en plus profondes.
Alors que l’extraction des métaux à partir de minerais à faible teneur consomme beaucoup d’énergie, l’utilisation de microorganismes permet de les libérer de façon plus écologique.
Les procédés utilisés dans l’hydrométallurgie microbiologique reposent sur l’action solubilisante des agents bactériens ou fongiques ou de leurs métabolites à une pression normale et à une température comprise entre 5°C et 80°C.
Parmi les champignons, Aspergillus ochraceus, Penicillium funiculosum et Rhizopus arrhizus possèdent la propriété d’adsorber de l’uranium à partir du minerai.
Penicillium simplicissimum extrait jusqu’à 80 % du titane à partir de la granodiorite et le nickel à partir de la latérite, Aspergillus niger extrait près de 90 % du cuivre des minerais carbonatés et silicatés, ainsi que l’aluminium des aluminosilicates, Penicillium lapidosum adsorbe le chrome et peut trouver un intérêt dans l’épuration des effluents de tanneries.

E - Biotransformation

Les biotransformations sont des réactions catalysées par des microorganismes ou leurs enzymes. Ø Elles possèdent l’avantage de réaliser en conditions non drastiques des réactions stéréospécifiques avec le minimum de réactions secondaires indésirables et présentent un rendement supérieur à celui de la catalyse chimique.
Ces réactions concernent les acides aminés, les vitamines, les antibiotiques, les prostaglandines ou les stéroïdes.
Actuellement, la plupart des acides aminés sont produits industriellement par hydrolyse des protéines, par synthèse chimique ou par biosynthèse microbienne.
La combinaison d’une synthèse chimique et d’une biotransformation présente l’avantage de pouvoir réaliser des synthèses remarquablement sélectives, comme :
- l’hydrolyse énantiosélective du racémique : la L-alanine, la L-méthionine, la L-phénylalanine, le L-tryptophane, la L-valine sont ainsi préparés par hydrolyse sélective des acyl-DL-acides aminés par la L-aminoacylase d’Aspergillus orizae, qui libère les acides aminés L. Il en est de même de la L-lysine, synthétisée par hydrolyse énantiosélective du DL-a-amino-e-caprolactame par les enzymes de Cryptococcus laurentii,
- la synthèse asymétrique : la L-phénylalanine est synthétisée à partir de l’acide transcinnamique et de l’ammoniaque par Rhodotorula gracilis et Sporobolomyces roseus.

Actuellement, la plupart des vitamines sont synthétisées par voie chimique.
Dans le cas de la vitamine E, la synthèse chimique produit le racémate, qui est transformé en isomère actif par diverses espèces bactériennes ou fongiques (Geotrichum candidum, Saccharomyces cerevisiae).
Il en est de même des caroténoïdes, dont la réduction énantiosélective est catalysée par Saccharomyces cerevisiae.
D’autres réactions peuvent être citées, comme la déshydrogénation du lapachol en déhydro-a-lapachol par Curvularia lanata, l’époxydation de l’acide 6-propénylphosphonique en fosfomycine par Penicillium spinulosum, la C-déméthylation de la griséofulvine en déméthylgriséofulvine par Botrytis alii, etc.
Dans le domaine de la biotransformation des antibiotiques, on peut citer la transformation de la pénicilline G ou V en acide 6-aminopénicillanique par Aspergillus oryzae, Fusarium moniliforme et F. conglomerans. Cet acide sert de molécules de base pour l’hémisynthèse de nouvelles pénicillines ou céphalosporines
La synthèse chimique des prostaglandines peut comporter des étapes microbiologiques, comme la bioconversion de prostaglandines par une chloroperoxydase de Caldariomyces fumago.
A partir d’acide désoxycholique, de stigmastérol ou de diosgénine, plusieurs réactions chimiques vont permettre de produire le composé S de Reichstein, servant de substrat pour les biotransformations. Celles-ci sont diverses, comme la 11-a-hydroxylation par Rhizopus nigricans ou Aspergillus ochraceus, la 11-b-hydroxylation par Curvularia lunata et Cunninghamella blakesleeana.

F - Biodépollution

Des levures peuvent être très utilement employées dans le traitement des effluents d’industrie : K. fragilis, G. candidum participent activement à la réduction des demandes biologique et chimique en oxygène.
Le procédé Symba met à profit l’action symbiotique de deux levures, Endomycopsis fibuliger et Candida utilis, dans le recyclage de boues riches en amidon.
Les effluents de distilleries de vins, les effluents d’huiles d’olive ou de mélasses d’oranges, très riches en matières organiques, renferment de plus des teneurs importantes de composés phénoliques. Or un prétraitement aérobie avec G. candidum fait chuter leurs taux de près de 90 % et augmente considérablement la vitesse de digestion anaérobie classique des effluents.